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帕金森病啮齿类动物模型的制备方法

点击次数:386 发布时间:2019-09-06

帕金森病啮齿类动物模型的制备方法

一、通过耗竭单胺类神经递质制作PD模型

(一)利血平模型

利血平是一种生物碱。通过不可逆地封闭囊内单胺运输消耗中枢和外周单胺,从而影响细胞内囊泡的单胺再循环,于20世纪50年代被用于制作大鼠PD模型。当啮齿类动物注射利血平后,囊内摄取的DA、5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NA)被封闭,在胞质内被降解,快速降低单胺水平,导致肌肉僵硬等PD的症状。

制备方法:应用雄性Wistar大鼠,腹腔内注射一定剂量的利血平后即可使其出现骨骼肌僵硬、震颤、姿势异常。该模型制作方法简单。其对人类大的贡献在于揭示出左旋多巴(L-DOPA)可作为治疗PD的潜在药物。缺点是只能短暂模拟PD的症状,不能完全复制自发性PD的病理变化。

(二)甲丨基丨苯丨丙丨胺模型

苯丨丙丨胺丨类药物是一类具有潜在成瘾性的神经兴丨奋丨剂,具有促DA释放作用,大剂量应用对啮齿类动物和非人类的灵长类动物具有神经毒性,像利血平一样,它能够导致DA能神经元末梢DA的耗竭,对黑质神经元损伤作用较小。Boirean等研究表明,该药可通过DA转运体被摄入细胞内,兴奋性氨基酸受体拮抗剂MK.801可阻断其毒性作用,体外实验提示能量代谢障碍、氧化应激和兴奋性氨基酸均与其毒性作用有关。制作方法:用成年大鼠,按体重10~25mg/kg皮下注射甲丨基丨苯丨丙丨胺,每天一次,连续4天。用药后可出现短暂活动过多,随之是活动减少。4~5d后可有“幻觉样”行为,表现为颤抖、舔毛、咬皮毛。1周后检测即可发现黑质和纹状体中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)活性降低,DA含量减少,但黑质 DA能神经元丢失不明显。该模型制作方法简单,是一个急性损伤模型,症状的持续时间及稳定性方面尚不理想,也无PD的特征性组织病理学改变。主要用于研究PD多巴胺耗竭后的纹状体生理、生化学改变,也可用于神经保护方面的研究。

二、神经毒素制作PD模型

对PD患者大脑的研究显示,在氧化应激过程中存在线粒体复合物Ⅰ功能的抑制,因而这可能是黑质DA神经退行性变的重要组成部分。对MPTP、6-羟基多巴胺(6-OHDA)和罗藤酮的研究已经为探索多巴胺神经元死亡的分子机制提供了希望。

MPTP是1982年在一组药物成瘾所致的亚急性重症帕金森病患者体内发现的。这种症状是由于这些人自己服用一些含有与人工合成的吗啡结构相似的药物所致。而这种药物被加工过程中的一些副产物MPTP所污染,这种副产物有高亲脂性并且能够通过血脑屏障。胶质细胞内的单胺氧化酶能将MPTP转化成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+),后者可以被DA转运体所摄取并在DA神经元内堆积。缺乏这种转运体的小鼠能避免MPTP的毒性损害。吸收的MPP+在线粒体内富集,它们能够抑制线粒体电子传递链中复合物Ⅰ的功能,从而使 ATP的生成减少并且产生活性氧自由基诱导DA神经元的凋亡。有趣的是,MPTP甚至能使具有中央神经系统的一些低级的无脊椎动物如扁形虫、三涡虫神经元死亡。这提示 MPTP对无脊椎动物和灵长类动物都具有神经毒性。故在灵长类动物,如人、猴、狒狒中, MPTP能引起不可逆的严重的帕金森病症状,这种症状与散发的PD不能区别。这其中包括黑质DA神经元的变性,微包涵体的出现[如嗜伊红性包涵体和α-synuclein的聚合体(并不是典型的Lewy体)],在电镜下观察,这些微包涵体由一个高密度的粒状核心和围绕其周围的放射状细丝晕组成。对灵长类动物予以MPTP处理后其显示出对左旋多巴(L-3,4二羟基多巴)及其他DA受体激动剂较好的应答。然而,采用MPTP毒素制作PD模型的主要缺点是PD是一种慢性发展的疾病,而MPTP所致的是急性或亚急性的发病过程。在灵长类动物中采用不同的剂量水平慢性给予MPTP已经显示能够产生缓慢发展的帕金森病症状,在纹状体中多巴胺纤维的损失不均匀,并且显示出在黑质部位DA神经元的选择性损耗。

6-OHDA是用来制作帕金森病动物模型的另一种药物。常用的方法是单侧注射6- OHDA至黑质或者中央前脑束,这可以使DA神经元细胞在较短的时间内快速死亡。这与急性MPTP模型相似。另外一种6-OHDA模型直接注射这种毒素到纹状体内而导致黑质神经元的退行性变。这种方法可以在4周内缓慢地损伤部分神经元,因而已经被用来模拟PD的慢性病程。

在向黑质注射6-OHDA之后,这些药物选择性地积聚在DA神经元,并对其产生毒性作用。这一过程可能是通过产生自由基而完成的。6-OHDA对大鼠、小鼠、猫及灵长类动物是一种的毒物,并且被广泛用来制作单侧损伤模型。在大鼠中广泛的DA损耗可以通过对给予安丨非丨他丨明和脱水吗啡引起的旋转活动来进行评估。这种模型主要的优点是可以计量运动减少(旋转),因而这一模型被证实在药理学研究中用来观察药物对多巴胺及其受体是否有效是非常有用的。

罗藤酮是一种天然的杀虫剂,其起源于某些特殊植物的根部,并且是一种线粒体复合物Ⅰ的高亲和力特异性抑制剂。Betarbet等证实大鼠通过颈静脉丛插管长期、系统地给予罗藤酮可以产生许多PD的特征,包括黑质纹状体多巴胺能神经元的变性和DA神经元内 Lewy体的形成。这些包涵体可以被泛肽和α-synuclein抗体所染色,电镜下观察,高密度的核心被纤维状物质环绕,这与Lewy体的结构非常相似。实验大鼠出现运动徐缓、姿态不稳、步态不稳及一些震颤的迹象,这些症状在给予DA受体激动剂脱水吗啡后得以改善,提示这种缓慢的罗藤酮给药法是一个较好的改进的简单给药法。

在大鼠黑质内单独注射MPP+、6-OHDA和罗藤酮引起不同的运动功能抑制。MPP+、6-OHDA和罗藤酮是多巴胺能的神经毒素,但是这些毒素对大鼠脑组织毒性作用的机制仍然不是很清楚,需要进一步深入研究。

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